一种无载体固定化酶制备大豆多肽的方法属于大豆多肽提取技术,该方法包括以下步骤:(1)将碱性蛋白酶溶解于磷酸盐缓冲液中,加入乙醇沉淀聚集后再加入戊二醛进行交联得交联酶聚集体即固定化碱性蛋白酶;(2)将大豆分离蛋白溶液加水混合配制成大豆分离蛋白溶液,调节pH和温度,再加入步骤(1)中得到的固定化酶进行酶解,酶解后回收固定化酶,酶解液经离心分离得上清液,上清液经冷冻干燥即得大豆多肽;本方法制备的无载体固定化碱性蛋白酶活性高,无需成本高昂的载体,同时将该固定化酶酶解大豆分离蛋白制备大豆多肽,所需的工艺设备简单,能耗低,且固定化酶可回收重复使用,减少资源浪费,节省成本。
1.一种无载体固定化酶制备大豆多肽的方法,其特征在于,该方法包括以下步骤:(1)将protex-6L碱性蛋白酶溶解于磷酸盐缓冲液中,加入乙醇沉淀聚集,所述的乙醇浓度50-90%,聚集时间10-50min,聚集后再加入戊二醛进行交联得交联酶聚集体即固定化碱性蛋白酶,所述的戊二醛浓度10-50%,交联时间1-3h;(2)将大豆分离蛋白加水混合配制成大豆分离蛋白溶液,调节pH和温度,再加入步骤(1)中得到的固定化酶进行酶解,酶解时间2-4h,加酶量3000-7000U/g,酶解pHxa08-10,酶解温度40-80°C,酶解后回收固定化酶,酶解液经离心分离得上清液,上清液经冷冻干燥即得大豆多肽。
2.根据权利要求1所述的一种无载体固定化酶制备大豆多肽的方法,其特征在于所述的固定化protex-6L碱性蛋白酶制备的优选参数为:乙醇浓度80%,聚集时间30min,戊二醛浓度40%,交联时间2.5h。
3.根据权利要求1所述的一种无载体固定化酶制备大豆多肽的方法,其特征在于所述的酶解优选参数为:酶解时间2.84h,加酶量5450U/g,酶解pHxa09.5,酶解温度50°C。技术领域
本发明属于大豆多肽提取技术,尤其涉及一种无载体固定化酶制备大豆多肽的方法。
背景技术
固定化酶是20世纪60年代发展起来的新技术,一般是将酶与不溶性载体结合起来,使酶在一定的空间内呈封闭状态,能连续的进行反应,反应后的酶通过过滤或离心等方法回收重复使用。固定化酶作为酶应用领域中的一个主要研究方向,目前大都通过将酶固定在不溶性聚合物或无机载体上,形成的固定化酶在大分子底物转化中由于聚合物载体的存在而大大降低了酶的结合容量和反应能力。此外,固定化使用的试剂和载体成本高昂、固定效率偏低,真正投入工业化应用的固定化酶不多,因而进一步开发更简便、更适用的固定化方法仍是该领域追求的目标。交联酶聚集体技术是一种无载体固定化酶技术,酶的固定化是通过对基本纯化的、高浓度的蛋白质样品的共价交联来实现的。与传统固定化酶相比,该固定化方法获得的固定化酶有较高的催化剂比表面,单位体积活性大、空间效率高,有较高的酶催化活性,受底物扩散限制的影响较小,在极端条件下及有机溶剂中和蛋白酶中的操作稳定性,成本低廉、设备简单,无需载体,应用范围广。然而将交联酶聚集体技术——无载体固定化酶技术应用于酶解大豆分离蛋白提取大豆多肽的研究未见报道,现有的提取大豆多肽的方法存在酶不能回收重复使用,成本高等问题。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服上述现有技术的不足,提供一种无载体固定化酶制备大豆多肽的方法,达到简化工艺、提高酶的重复利用率及降低成本的目的。本发明所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的:一种无载体固定化酶制备大豆多肽的方法,该方法包括以下步骤:(1)将protex-6L碱性蛋白酶溶解于磷酸盐缓冲液中,加入乙醇沉淀聚集,所述的乙醇浓度50-90%,聚集时间10-50min,聚集后再加入戊二醛进行交联得交联酶聚集体即固定化碱性蛋白酶,所述的戊二醛浓度10-50%,交联时间1-3h;(2)将大豆分离蛋白加水混合配制成大豆分离蛋白溶液,调节pH和温度,再加入步骤(1)中得到的固定化酶进行酶解,酶解时间2-4h,加酶量3000-7000U/g,酶解pHxa08-10,酶解温度40-80°C,酶解后回收固定化酶,酶解液经离心分离得上清液,上清液经冷冻干燥即得大豆多肽。所述的固定化protex-6L碱性蛋白酶制备的优选参数为:乙醇浓度80%,聚集时间30min,戊二醛浓度40%,交联时间2.5h。所述的酶解优选参数为:酶解时间2.84h,加酶量5450U/g,酶解pHxa09.5,酶解温度50°C。本发明方法采用无载体固定化碱性蛋白酶,首先用沉淀剂聚集酶,再加入交联剂使酶聚集体交联,即得交联酶聚集体——固定化碱性蛋白酶,该固定化酶由于无需成本高昂的载体,因此大大降低了成本,应用此固定化酶酶解大豆分离蛋白提取大豆多肽,提取工艺简单,并且酶可回收重复使用,减少了资源的浪费。
附图说明
xa0xa0xa0图1xa0是本发明方法的工艺路线图;xa0xa0xa0图2xa0乙醇浓度对酶活力回收率的影响;图3xa0聚集时间对酶活力回收率的影响;图4xa0戊二醛浓度对酶活力回收率的影响;图5xa0交联时间对酶活力回收率的影响;图6xa0酶解时间与加酶量交互对多肽提取率的响应面;图7xa0酶解时间与酶解pH交互对多肽提取率的响应面;图8xa0加酶量与酶解温度交互对多肽提取率的响应面;图9xa0酶解pH与酶解温度交互对多肽提取率的响应面。具体实施方案下面结合附图对本发明具体实施例进行详细描述,一种无载体固定化酶制备大豆多肽的方法,该方法包括以下步骤:(1)将protex-6L碱性蛋白酶溶解于磷酸盐缓冲液中,加入乙醇沉淀聚集,所述的乙醇浓度50-90%,聚集时间10-50min,聚集后再加入戊二醛进行交联得交联酶聚集体即固定化碱性蛋白酶,所述的戊二醛浓度10-50%,交联时间1-3h;(2)将大豆分离蛋白加水混合配制成大豆分离蛋白溶液,调节pH和温度,再加入步骤(1)中得到的固定化酶进行酶解,酶解时间2-4h,加酶量3000-7000U/g,酶解pHxa08-10,酶解温度40-80°C,酶解后回收固定化酶,酶解液经离心分离得上清液,上清液经冷冻干燥即得大豆多肽。所述的固定化protex-6L碱性蛋白酶制备的优选参数为:乙醇浓度80%,聚集时间30min,戊二醛浓度40%,交联时间2.5h。所述的酶解优选参数为:酶解时间2.84h,加酶量5450U/g,酶解pHxa09.5,酶解温度50°C。实施例1:制备无载体固定化碱性蛋白酶最佳参数的筛选试验1材料与方法1.1材料、试剂 protex-6L碱性内切蛋白酶 丹麦novo公司 磷酸氢二钠 市售分析纯 磷酸二氢钠 市售分析纯 乙醇 市售分析纯 戊二醛 市售分析纯 1.2主要仪器设备 pHS-25型酸度计 上海伟业仪器厂 电子分析天平 梅勒特-托利多仪器(上海)有限公司 离心机 北京医用离心机厂 电热恒温水浴锅 余姚市东方电工仪器厂 冷冻干燥机 上海纤检仪器有限公司 1.3试验方法1.3.1无载体固定化碱性蛋白酶的制备称取一定量碱性蛋白酶,与pH为7的磷酸氢二钠/磷酸二氢钠缓冲液混合,于室温下再滴加无水乙醇沉淀聚集,同时边滴加边搅拌,待游离的蛋白酶完全沉淀后离心分离得沉淀物。向此沉淀中滴加一定浓度的戊二醛交联剂,再次搅拌令其混合均匀,于4°C下交联一定时间后离心取沉淀物,用磷酸盐缓冲液洗涤数次,最终分离得到沉淀冻干得交联酶聚集体,即无载体固定化碱性蛋白酶。1.3.2xa0酶活力测定碱性蛋白酶酶活力测定采用标准SB/T13017-1999,即福林-酚法测定碱性蛋白酶酶活,固定化酶活力单位为U/g。相对酶活力,以酶活力最大值为100%,其余数值与其对比,即相对酶活力,以百分数表示。 ntent="drawing" img-format="jpg" inline="no" orientation="portrait" wi="348"/> 2结果与讨论2.1最适乙醇浓度的确定由图2可知,当聚集pH为7,聚集温度为25°C,聚集时间为30min时,以酶活力回收率为考察指标,分别选取乙醇浓度为50%、60%、70%、80%、90%进行沉淀聚集反应,确定最适乙醇浓度为80%。2.2最适聚集时间的确定由图3可知,当聚集pH为7,聚集温度为25°C,乙醇浓度为70%时,以酶活力回收率为考察指标,分别选取聚集时间为10min、20min、30min、40min、50min进行沉淀聚集反应,确定最适聚集时间为30min。2.3最适戊二醛浓度的确定由图4可知,当交联pH为5,交联温度为4°C,交联时间为2h时,以酶活力回收率为考察指标,分别选取戊二醛浓度为10%、20%、30%、40%、50%进行交联反应,确定最适戊二醛浓度为40%。2.4最适交联时间的确定由图5可知,当交联pH为5,交联温度为4°C,戊二醛浓度为30%时,以酶活力回收率为考察指标,分别选取交联时间为1h、1.5h、2h、2.5h、3h进行交联反应,确定最适交联时间为2.5h。xa0实施例2:酶解工艺最佳参数的筛选试验1材料与方法1.1材料、试剂 大豆分离蛋白 哈高科 protex-6L碱性内切蛋白酶 丹麦novo公司 磷酸氢二钠 市售分析纯 磷酸二氢钠 市售分析纯 乙醇 市售分析纯 戊二醛 市售分析纯 1.2主要仪器设备 pHS-25型酸度计 上海伟业仪器厂 电子分析天平 梅勒特-托利多仪器(上海)有限公司 离心机 北京医用离心机厂 精密电动搅拌机 江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司 电热恒温水浴锅 余姚市东方电工仪器厂 恒温培养箱 北京市永光明医疗仪器厂 冷冻干燥机 上海纤检仪器有限公司 1.3试验方法1.3.1工艺流程大豆分离蛋白→加水混合→调节pH和温度→加入固定化酶酶解→回收固定化酶→酶解液→离心分离→上清液→冷冻干燥→大豆多肽1.3.2计算公式 ntent="drawing" img-format="jpg" inline="no" orientation="portrait" wi="354"/> 2结果与讨论2.1xa0试验因素水平编码表在单因素研究的基础上,选取酶解时间、加酶量、酶解pH、酶解温度4个因素为自变量,以多肽提取率为响应值,根据中心组合设计原理,设计响应面分析试验,其因素水平编码表见表表2-1。表2-1xa0因素水平编码表 ntent="drawing" img-format="jpg" inline="no" orientation="portrait" wi="455"/> 2.2xa0响应面实验安排及实验结果本实验应用响应面优化法进行过程优化。以A、B、C、D为自变量,以多肽提取率为响应值R,响应面实验方案及结果见表2-2。实验号1-24为析因实验,25-36为12个中心试验,用以估计实验误差。表2-2xa0试验安排及结果 ntent="drawing" img-format="jpg" inline="no" orientation="portrait" wi="452"/> 2.3响应面试验结果分析多肽提取率R通过统计分析软件Design-Expert进行数据分析,建立二次响应面回归模型如下:R=64.98+2.84A+3.60B+2.67C-3.50D-5.27AB-2.92AC+1.12AD+0.62BC+1.83BD-4.04CD-0.16A²-2.77B²-1.37C²-1.68D²多肽提取率R的回归与方差分析结果见表2-3,交互相显著的响应面分析见图6-图9。表2-3多肽提取率的回归与方差分析结果 变量 自由度 平方和 均方 F值 Pr>F A 1 193.23 193.23 25.19 <0.0001 B 1 311.76 311.76 40.64 <0.0001 C 1 171.20 171.20 22.32 0.0001 D 1 293.30 293.30 38.23 <0.0001 AB 1 444.16 444.16 57.89 <0.0001 AC 1 136.31 136.31 17.77 0.0004 BD 1 53.66 53.66 6.99 0.0152 CD 1 261.63 261.63 34.10 <0.0001 A² 1 0.79 0.79 0.10 0.7512 B² 1 245.50 245.50 32.00 <0.0001 C² 1 60.04 60.04 7.83 0.0108 D² 1 90.56 90.56 11.80 0.0025 回归 14 2288.29 163.45 21.31 <0.0001 剩余 21 161.11 7.67 xa0 xa0 失拟 10 75.05 7.50 0.96 0.5223 误差 11 86.06 7.82 xa0 xa0 总和 35 2449.40 xa0 xa0 xa0 由表2-3可知,方程因变量与自变量之间的线性关系明显,该模型回归显著(p<0.0001),失拟项不显著(p>0.05),并且该模型R²=xa093.42%,R²_Adj=xa089.04%,说明该模型与试验拟合良好,自变量与响应值之间线性关系显著,可以用于该反应的理论推测。由F检验可以得到因子贡献率为:B>D>A>C,即加酶量>酶解温度>酶解时间>酶解pH。应用响应面寻优分析方法对回归模型进行分析,寻找最优响应结果酶解时间2.84h,加酶量5450U/g,酶解pHxa09.5,酶解温度50°C,响应值多肽提取率有最优值为73.79%左右。2.4验证试验与对比试验在响应面分析法求得的最佳条件下,即酶解时间2.84h,加酶量5450U/g,酶解pHxa09.5,酶解温度50°C,进行3次平行试验,3次平行试验多肽提取率的平均值为72.48%。说明响应值的试验值与回归方程预测值吻合良好。